Сравнительная оценка результатов исследования антиокислительной активности фитопрепаратов методом хемилюминесценции в опытах IN VITRO и IN VIVO

Р. Р. Фархутдинов, Ю. Г. Азнабаева, Р. Р. Каспранский, М. В. Гордеев

Башкирский государственный медицинский университет, Уфа

Российский государственный научно-исследовательский испытательный центр подготовки космонавтов им. Ю. А. Гагарина, Москва

ООО «Травы Башкирии», Уфа

Общебиологический характер процессов свободнорадикального окисления (СРО) считается признанным фактом, а нарушение механизмов его регуляции – универсальным фактором повреждения мембран [5, 6]. В настоящее время выдвинуто положение о СРО как механизме срочной и долговременной адаптации организма к факторам окружающей среды [4]. Уровень СРО определяется показателями двух конкурентных систем – скоростью радикалообразующих процессов и состоянием эндогенной системы антиоксидантной (АО) защиты. Усиление радикальных процессов неизбежно приводит к накоплению токсичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и развитию синдрома пероксидации (СП) [2]. На клеточном уровне изменяется ферментативная активность мембран, наблюдаются их дестабилизация (фосфолипидный флип-флоп), повышение проницаемости, нарушение клеточной системы детоксикации и деления клеток, разобщение окислительного фосфорилирования и др. [1]. На организменном уровне СП проявляется в развитии свободнорадикальных патологий [23].

Восстановление свободнорадикального гомеостаза путем обеспечения полноценного функционирования АО систем организма рассматривается как важный патогенетический компонент профилактики, лечения и реабилитации многих заболеваний неинфекционной и инфекционной этиологии [10, 15]. В этой связи становятся актуальными разработка и внедрение в клиническую практику новых синтетических препаратов АО действия [8, 12, 14], а также исследование АО свойств уже известных фармакологических препаратов, терапевтический эффект которых в ряде случаев объясняется вероятным наличием этих свойств. В контексте обсуждаемой проблемы следует отметить, что многими клиницистами предпочтение отдается АО естественного происхождения, сопоставимыми по антиокислительной активности (АОА) с синтетическими, но не обладающими побочными эффектами последних [3, 7]. Преимущества природных АО, а также широкое использование населением различных официнальных растительных сборов и отдельных лекарственных растений и явились основанием для выбора объекта исследования – фитосборов фирмы «Травы Башкирии».

Важность рассматриваемой проблемы и большая практическая потребность в исследовании АОА лекарственных средств выдвигает задачу обоснования унифицированных и интегральных методов оценки применительно к скрининговым исследованиям. С этой целью нами проведена сравнительная оценка методов выявления суммарной АОА фитосборов в опытах на модельных системах in vitro и в экспериментальных исследованиях на животных.

Материалы и методы исследования. В опытах in vitro исследованы 2% водные настои (в пересчете на сухое вещество) 10 растительных сборов в дозах 0,01; 0,1 и 1 мг/мл (табл. 1). В модельных системах имитировались свободнорадикальные процессы, наиболее часто протекающие в организме. Генерация активных форм кислорода (АФК) изучалась в среде цитрат-фосфат-люминол [19], процессы ПОЛ – в фосфатнобуферной суспензии желточных липопротеидов [9]. В качестве инициирующих агентов применялись ионы Fe²⁺ как наиболее вероятные индукторы свободнорадикальных процессов in vivo [6]. По изменению хемилюминесценции (ХЛ) модельных систем, возникающей при рекомбинации радикалов, оценивалась суммарная АОА фитосборов. Дополнительно определялось влияние фитосборов на спонтанную люминолзависимую ХЛ (ЛЗХЛ) донорской человеческой цельной крови [19]. Регистрация ХЛ проводилась на приборе ХЛМ-003. Интегральными показателями кинетических реакций являются светосумма свечения (СС) и максимальное свечение (МС) [16, 18].

В опытах in vivo в качестве объекта исследования использованы белые крысы-самцы линии Вистар массой тела 225±25 г. Все животные были разделены на 3 группы по 8 особей в каждой: I группа получала сбор «Лакричный», II группа – сбор «Вечерний», III группа – контрольная. Фитосборы вводили животным per os ежедневно в течение 21 дня в дозе, эквивалентной терапевтической для человека, – 0,1 г/кг в виде 2% водных настоев. Животным контрольной группы в соответствующем объеме вводили дистиллированную воду. Все процедуры в эксперименте на животных выполнялись в соответствии с положениями Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии.

Изучение процессов СРО в организме животных проводилось на основе регистрации железоиндуцированной ХЛ плазмы и внутренних органов (гомогенатов печени, почек, головного мозга) и определения содержания в них малонового диальдегида (МДА) [6, 19]. Исследовалась спонтанная и индуцированная зимозаном ЛЗХЛ цельной крови животных [19]. Влияние фитосборов оценивалось по изменению АОА гомогенатов тканей и биологических жидкостей в сравнении с контрольной группой.

Для дополнительного исследования фагоцитарной активности лейкоцитов крови изучался фагоцитоз латексных частиц [13].

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы «Primer of Biostatistics, version 4.03», дисперсионным анализом и по критерию Стьюдента.

Результаты и их обсуждение. В опытах in vitro фитосборы проявили различную АОА (табл. 1). В дозе 0,1 мг/мл, сопоставимой с терапевтической, ингибирование более 50% свободнорадикальных реакций наблюдалось: в системе, генерирующей АФК, под действием половины фитосборов («Лакричный», «Лань», «Руслан и Людмила», «Солнышко», «Горец»), в системе ПОЛ – под действием всех фитосборов. Различная выраженность АОА фитосборов в моделях, продуцирующих в основном разные типы радикалов, вероятно, связана с преобладанием у них антирадикальных свойств над антиоксидантными, что является характерным для природных АО [20].

На свечение цельной крови, обусловленное преимущественно нейтрофильными гранулоцитами [16], фитосборы оказали стимулирующее влияние. Генерация биооксидантов возросла с 6% (сборы «Лакричный», «Витаминный») до 34% (сборы «Вечерний», «Горец»). ЛЗХЛ нейтрофилов тесно связана с системой миелопероксидазы и отражает продукцию гидроксильного радикала (ОН΄), определяющего бактерицидную активность [22]. Известно, что синтетические АО (ионол, мексидол), напротив, подавляют свечение фагоцитов [21].

Важно отметить, что для биоантиоксидантов характерны максимальное проявление их свойств в определенном концентрационном интервале и ослабление эффективности действия с увеличением концентрации вплоть до развития, в ряде случаев обратного эффекта [20]. Из табл. 1 видно, что рост АО свойств фитосборов наблюдался в пределах от 0,01 до 1 мг /мл. В опытах in vitro другими исследователями [17] отмечено резкое снижение стимулирующего влияния водных настоев фитопрепаратов на фагоциты цельной крови в концентрациях от 3 до 30 мг/мл.

Таблица 1. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ФИТОСБОРОВ НА ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЮ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ (В у. е.)

* Р<0,05.

В эксперименте на животных были исследованы фитосборы «Лакричный» и «Вечерний», оказавшие наибольшее воздействие на СРО in vitro. Под их влиянием ХЛ гомогенатов печени, которая выполняет повышенную детоксикационную нагрузку и в этой связи процессы ПОЛ в ней протекают особенно интенсивно [11], уменьшилась примерно в 2 раза; ХЛ плазмы крови – примерно в 1,5 раза (табл. 2). В гомогенатах мозга и почек интенсивность ХЛ незначительно снизилась по сравнению с контрольной группой. Это может объясняться тем, что введение в организм экзогенных биоантиоксидантов при наличии сбалансированной АО защиты приводит к интенсификации окисления липидов, ускорению утилизации избытка АО и возвращению окислительных реакций на исходный стационарный уровень [20]. Следует отметить, что наряду с изменениями ХЛ плазмы и гомогенатов внутренних органов выявлено адекватное накопление вторичного продукта ПОЛ – МДА.

Таблица 2. ИЗМЕНЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЖЕЛЕЗО-ИНДУЦИРОВАННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ (В У. Е.) И СОДЕРЖАНИЯ МДА (В ЕД. ОПТ. ПЛОТНОСТИ) В ПЛАЗМЕ КРОВИ И ГОМОГЕНАТАХ ОРГАНОВ ПРИ ВВЕДЕНИИ ФИТОСБОРОВ ЖИВОТНЫМ

Таблица 3. ИЗМЕНЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЛЮМИНОЛЗАВИСИМОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ ПРИ ВВЕДЕНИИ ФИТОСБОРОВ ЖИВОТНЫМ (В У. Е.)

Свечение цельной крови животных под влиянием фитосборов «Лакричный» и «Вечерний» изменилось более выраженно, чем in vitro (табл. 3). Спонтанная ЛЗХЛ фагоцитов цельной крови возросла в 2–2,5 раза, индуцированная ЛЗХЛ, отражающая готовность клеток к «респираторному взрыву», – в 3–4 раза. Разность между уровнями МС индуцированной и спонтанной крови раскрывает абсолютную величину резервных возможностей фагоцитов. На фоне введения сборов «Лакричный» и «Вечерний» эта величина превысила контрольную в 3,5 и 3 раза соответственно (в I группе – 11,03±4,08 у. е., р>0,1, во II группе – 9,51±2,83 у.е., р<0,05, в контрольной группе – 3,13±0,39 у. е.).

Результаты изучения фагоцитоза латексных частиц лейкоцитами крови коррелировали с показателями ХЛ фагоцитов крови: возросла поглотительная способность каждого фагоцита при неизменном общем их количестве (в I группе фагоцитарное число увеличилось до 2,75±0,26, р=0,04, во II группе до 2,33±0,27, р=0,32 по сравнению с контролем – 2,05±0,14; фагоцитарный показатель достоверно не изменился – в I группе 33,17±5,06, р=0,42, во II группе 33,67±3,85, р=0,36, в контрольной группе 37,80±2,25).

Таким образом, АОА растительных сборов «Лакричный» и «Вечерний», выявленная in vitro, подтверждена в эксперименте на животных.

Выводы:

1. Все изученные растительные сборы в различной степени обладают АОА, которая достаточно выражена у большинства фитосборов, в т. ч. у сборов «Лакричный» и «Вечерний». Растительные АО сборов подавляют генерацию АФК и процессы ПОЛ в модельных системах, но стимулируют продукцию АФК фагоцитами цельной крови.

2. Под влиянием фитосборов «Лакричный» и «Вечерний» у экспериментальных животных увеличилась АОА органов и плазмы крови (по показателям ХЛ и МДА), повысилась фагоцитарная активность лейкоцитов крови и их резервные возможности.

3. Сравнительный анализ результатов исследования влияния растительных АО на ХЛ в модельных системах in vitro и в опытах на животных показал однонаправленность их изменений, адекватных динамике содержания в биосредах одного из вторичных продуктов СРО – МДА.

4. Использование изученных модельных систем и метода регистрации хемилюминесценции может быть рекомендовано для проведения скрининговых исследований по выявлению суммарной АОА лекарственных препаратов, включая отдельные лекарственные растения и их сборы.

Литература

1. Абрамова Ж. И., Оксенгендлер Г. И. Человек и противоокислительные вещества. – Л.: Наука, 1985.

2. Бобырев В. Н., Почерняева В. Ф., Стародубцева С. Г. и др. Специфичность систем антиоксидантной защиты органов и тканей – основа дифференцированной фармакотерапии антиоксидантами //Экспериментальная и клиническая фармакология. – 1994. – № 1. – С. 47–53.

3. Вартанян Л. С., Гуревич С. М. Влияние ионола на метаболизм супероксидных радикалов в печени мышей // Русский медицинский журнал. – 1999. – № 4.

4. Величковский Б. Т. Свободнорадикальное окисление как звено срочной и долговременной адаптации организма к факторам окружающей среды // Вестник РАМН. – 2001. – № 6. – С. 45–52.

5. Владимиров Ю. А., Азизова О. А., Деев А. И. и др. Свободные радикалы в живых системах / ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Сер. Биофизика.– М., 1991. – Т. 29.

6. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. – М., 1972. – 252 с.

7. Дурнев В. А., Середенин С. Б. Фармакологические проблемы поиска и применения антимутагенов // Вестник РАМН. – 1993. – № 1. – С. 19–26.

8. Ибатуллина Р. Б., Мышкин В. А., Сергеева С. А., Максимов Г. Г. и др. Профилактическая эффективность тиетазола и оксиметилурацила при воздействии хлорфенолов // Медицина труда и промышленная экология. – 2002. – № 5. – С. 16–19.

9. Клебанов Г. И., Бабенкова И. В., Теселкин Ю. О. и др. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лабораторное дело. – 1988. – № 5. – С. 59–62.

10. Коган А. Х., Кудрин А. Н., Кактурский Л. В., Лосев Н. И. Свободнорадикальные перекисные механизмы патогенеза ишемии и инфаркта миокарда и их фармакологическая регуляция // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 1992. – № 2. – С. 5–15.

11. Логинов А. С., Матюшин Б. Н. Внутриклеточная активация кислорода и молекулярные механизмы автоокислительного повреждения печени // Вестник РАМН. – 1994. – № 5. – С. 3–7.

12. Максимов Г. Г. и др. // Медицина труда. – 1995. – № 12. – С. 14–16.

13. Методические рекомендации по экспериментальныму изучению иммунотоксических свойств химических факторов окружающей среды. – М., 1989. – С. 21–22.

14. Мышкин В. А. Коррекция перекисного окисления липидов при экспериментальных интоксикациях различными химическими веществами: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. – Челябинск, 1998.

15. Петрович Ю. А., Гуткин Д. В. Свободнорадикальное окисление и его роль в патогенезе воспаления, ишемии и стресса // Патолог. физиология и экспериментальная терапия. – 1986. – № 5. – С. 85–92.

16. Пикуза О. И., Адо Е. И., Делян В. Ю. Клинические аспекты применения хемилюминесцентного анализа // Казанский медицинский журнал. – 1996. – Т. 77, № 4. – С. 298–300.

17. Рыжикова М. А. Сравнительная оценка влияния водных извлечений из лекарственного растительного сырья некоторых лекарственных растений на процессы свободнорадикального окисления: Автореф. дис. … канд. биол. наук. – Волгоград, 1999.

18. Токмаков А. А. Применение люминола в аналитической химии //Успехи современной биологии. – 1993. – Т. 113, вып. 2. – С. 247–256.

19. Фархутдинов Р. Р., Лиховских В. А. Применение хемилюминесцентных методов в медицине и биологии. – Уфа, 1995. – 110 с.

20. Храпова Н. Г. О взаимозаменяемости природных и синтетических антиоксидантов. /Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. – М.: Наука, 1982. – С. 59–73.

21. Ball S. S., Weindruch R., Walford R. L. Antioxidants and immune response // Free radic., aging and degenerative diseases. – 1986. – P. 427–456.

22. Horan T. D.,Erolish D., Mc. Pherson T. A. //Clin. immunol. Immunopath. – 1982. – Vol. 22. – P. 259–269.

23. Pryoz W. // Free radicals in molecular biology, aging and disease. – New York, 1984. – P. 13–41.